La cloroquina 124

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La cloroquina activa la vía de p53 e induce la apoptosis en células de glioma humano Ella L. Kim. Robin Wstenberg. Anne Rbsam. Christoph Schmitz-Salue. Gabriele Warnecke. Eva-Maria Bcker. Nadine Pettkus. Daniel Speidel. Veit Rohde. Walter Schulz-Schaeffer. Wolfgang Deppert y Alf Giese La traslacional Neurooncología Grupo de Investigación, Departamento de Neurocirugía. Universidad Georg-August Göttingen, Göttingen. Alemania (ELKARCS-SE-MBNPVRAG) Universidad de la Escuela de Medicina de Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Lübeck, Alemania (RW) Heinrich-Pette-Institute, Hamburgo, Alemania (GWWD) Unidad de Transformación Celular Childrens Medical Research Institute, Westmead, Nueva Gales del Sur wales, Australia (DS) del Departamento de Neuropatología, Universidad Georg-August Göttingen, Göttingen, Alemania (WS-S.) Autor correspondiente: Alf Giese, MD, La Neurooncología Grupo de Investigación traslacional, Departamento de Neurocirugía. Universidad Georg-August Gotinga, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Göttingen. Alemania (alf. giese med. uni-goettingen. de). Ella Kim, PhD, Neurooncología El Grupo de Investigación Traslacional, Departamento de Neurocirugía, Universidad Georg-August Gotinga, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Göttingen, Alemania (ella. kim med. uni-goettingen. de). Recibido el 21 de octubre de 2008. Aceptado 22 de junio de 2009. Resumen El glioblastoma es el tumor cerebral maligno más común en los adultos. Los tratamientos disponibles en la actualidad sólo ofrecen una ventaja de supervivencia paliativos y la necesidad de tratamientos eficaces sigue siendo una prioridad urgente. La activación de la vía de la supresión del crecimiento de p53 / apoptosis es una de las estrategias prometedoras en la orientación de las células de glioma. Se demuestra que la cloroquina derivado de quinolina activa la vía de p53 y suprime el crecimiento de células de glioma in vitro e in vivo en un (U87MG) glioblastoma humano modelo de ratón ortotópico. La inducción de la apoptosis es uno de los mecanismos subyacentes a los efectos de la cloroquina sobre la supresión del crecimiento de células de glioma y la viabilidad. siRNA mediada por la regulación negativa de p53 de tipo salvaje, pero no en las células de glioblastoma p53 mutante afectado sustancialmente la apoptosis inducida por cloroquina. Además de sus efectos de p53 de activación, la cloroquina también puede inhibir el crecimiento de células de glioma a través de mecanismos independiente de p53. Nuestros resultados clarifican la base mecánica subyacente el efecto antineoplásico de la cloroquina y revelan su potencial terapéutico como un complemento a la quimioterapia glioma. Palabras clave glioblastoma es el tumor cerebral maligno más común en los adultos. Debido a su notoria por radiación y la quimio-resistencia, la recurrencia de los glioblastomas después de la resección quirúrgica y por la radiación y la quimioterapia adyuvante es inevitable, con un resultado invariablemente letal. Los tratamientos disponibles en la actualidad sólo ofrecen una ventaja de supervivencia paliativos, lo que subraya la necesidad de tratamientos más eficaces el una prioridad urgente. 1, 2 Orientación de vías de señalización intracelular implicadas en la regulación del crecimiento y de viabilidad de las células de glioma es la base molecular de varias estrategias terapéuticas experimentales. 3 5 En la última década, la activación de la vía inhibidora del crecimiento endógeno p53 o restauración de las funciones de p53 en células de glioma mediante la introducción de p53 de tipo salvaje exógena (wtp53) ha sido una estrategia intensamente explorado para suprimir la progresión de glioma. supresor p53 6 10 El tumor puede inhibir potentemente el crecimiento celular mediante la inducción de un bloque transitoria o permanente de la proliferación o mediante la activación de programas de muerte celular en respuesta a diferentes tipos de estrés celular, que ha proporcionado una base para terapias contra el cáncer basadas en p53. 11 13 Además, la relevancia de las terapias basadas en p53 para el tratamiento de glioma se destaca por el hecho de que p53in contraste con la mayoría de otros tumorsis sólido con poca frecuencia mutado en primaria o de novo glioblastomas (menos de 30 mutaciones en el gen TP53, 14 se producen con más frecuencia forma de este tumor). 15 Un ensayo de fase I proporcionan evidencia convincente de que se restablezcan las funciones wtp53 mediante la introducción de wtp53 exógeno es un enfoque viable. 7, 10 Sin embargo, la expresión de wtp53 recombinante en células de glioma activa eficazmente los puntos de control del ciclo celular dependiente de p53, pero falla para inducir la apoptosis, 10 que desde un punto de vista terapéutico sería el resultado más deseado. 16 Un enfoque alternativo para activar la respuesta de apoptosis dependiente de p53 se basa en la capacidad de algunos agentes para activar la vía de p53 endógeno, ya sea por agentes que dañan el ADN o por los agentes que pueden estabilizar la proteína p53 en la ausencia de daños en el ADN. 17 En este contexto, los posibles efectos antitumorales de quinolinas han atraído recientemente un interés considerable. 18 20 La cloroquina es un agente membrana penetrable aminoquinolinic capaz de intercalarse en el ADN de doble cadena sin causar daño físico a la ADN. 21 Debido a sus propiedades de base débil, la cloroquina también se acumula en los lisosomas y puede desencadenar la apoptosis a través de la inhibición de la degradación de la proteína autofagia. 22 26 Ampliamente conocido como un medicamento contra la malaria y antirheumatoid, la cloroquina ha surgido recientemente como un agente anticancerígeno potencial. Los efectos citotóxicos de la cloroquina se han demostrado para las células tumorales derivadas de diferentes tipos de cánceres humanos. 22, 23, 27, 28 Los efectos de la cloroquina en las células de glioma no se han investigado sistemáticamente con anterioridad, pero hay evidencia empírica de que la cloroquina puede suprimir la progresión clínica de glioma por mecanismos desconocidos. 29, 30 Movido por estos hallazgos, se han examinado los efectos de la cloroquina sobre el crecimiento y la viabilidad de las células de glioma in vitro e in vivo. En este estudio, hemos demostrado que la cloroquina induce la apoptosis en células de glioma in vitro y suprime el crecimiento de gliomas experimentales in vivo. Nuestros resultados demuestran que el tratamiento con cloroquina en una estabilización sostenida de la proteína p53 e induce la actividad transcripcional de p53 en células de glioma. Además, se muestra que la cloroquina muestra actividad citotóxica independiente de la activación de la vía de p53 en las células con función de p53 deficiente, aunque en comparación con menos eficiencia con células de glioma con wtp53 funcional. Materiales y Métodos Células y anticuerpos Las líneas celulares de glioma humano utilizados en el estudio se han caracterizado previamente con respecto a su estado funcional de p53. 31 Las células se propagaron en medio esencial mínimo (Biochem) suplementado con suero de ternera fetal 10. Una solución concentrada cloroquina se preparó para cada experimento mediante la disolución de la sal de sodio de la cloroquina en PBS, filtrar a esterilizar, y se diluyó a la concentración deseada en medio de cultivo celular. Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados después de tratamiento con cloroquina, se lavaron en PBS enfriado con hielo, y se lisaron en tampón de lisis celular SDS (50 mmol / L Tris HCl, pH 8,0, 150 mmol / L de NaCl, y 1 SDS) que contiene inhibidores de la proteasa ( Roche). p53 humano se detectó por el anticuerpo DO-7 (BD Pharmingen) o el 16G8 anticuerpo que reconoce la proteína p53 fosforilación sensible fosforilada en Ser15 (Cell Signaling Technology, Inc.). Otros anticuerpos utilizados en el estudio incluyen aquellos contra p21, MDM2, TBP (Santa Cruz Biotechnology), PIG3 (Calbiochem), tubulina (Oncogene), bax (Upstate), o exfoliados caspasa-3 (Cell Signaling Technology, Inc.). Para los análisis de Western blot, las células se lisaron en tampón de lisis celular que contienen SDS-suplementado con inhibidores de proteasa. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich) y la igualada mediante el uso de tampón de lisis SDS. Evaluación del crecimiento celular, la muerte celular y la apoptosis Para evaluar los efectos de la cloroquina sobre el crecimiento celular, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,5 10 3 células / pocillo 1 día antes del tratamiento. Después de 24 horas de incubación, el tratamiento con cloroquina se inició por adición de cloroquina a la concentración deseada para el medio. Después de 24 horas de incubación con cloroquina, las células se lavaron con PBS estéril y se rellenaron con medio fresco. Las células en 6 pocillos replicados se fijaron con glutaraldehído al 3 intervalos de 24 horas. Después de 8 días consecutivos, las células fijadas se tiñeron con el colorante cristal violeta de ADN, se lavaron con PBS, y el colorante se solubilizó en tampón que contiene SDS 1. Se midió la absorbancia a 560 nm y se representó frente al tiempo de incubación. Para evaluar la muerte celular, el porcentaje de células no viables se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Para estimar las tasas de apoptosis, el porcentaje de células apoptóticas se determinó contando el número de células inmunoteñidas positivos para la caspasa-3 activada. la fragmentación del ADN de apoptosis se evaluó mediante la detección de inmunofluorescencia de dUTP mediada por TdT etiquetado nick-terminal (TUNEL) células positivas (ADN ApoAlert fragmentación Assay Kit, Clontech, Takara Bio). Para evaluar los efectos de la cloroquina sobre la integridad de la función de la membrana mitocondrial, las células no tratadas o tratadas a la cloroquina se tiñeron con el colorante catiónico fluorescente (5,5,6,6-tetracloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine yoduro de JC -1 membrana mitocondrial Kit de detección de potencial, Stratagene), que forma agregados fluorescentes rojas en la mitocondria de las células sanas, pero no en las células apoptóticas. 32 Red (excitación 550 nm, emisión 600 nm) y verde (excitación 485 nm, emisión 535 nm) de fluorescencia se midió utilizando un lector de placas Spectrafluor (TECAN) para determinar las relaciones de fluorescencia roja / verde. siRNA Transfections y tinción de inmunofluorescencia Las células se sembraron en cubreobjetos en placas de cuture tejidos de 24 pocillos a una densidad de 0.61.0 10 5 células / ml durante al menos 24 horas antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con validado comercialmente p53-siRNA (TP53 Validado cautela, Invitrogen) o inespecíficos siRNA revueltos (Stealth Control Negativo, Invitrogen) usando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones de los proveedores. Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 una en PBS, y se permeabilizaron en acetona / metanol frío (1: 1) mezcla durante la noche. El paraformaldehído-fijos y células permeabilizadas se lavaron en 0,5 BSA en PBS, se bloquearon en el mismo tampón, y se incubaron con anticuerpo anticleaved caspasa-3 a 4ºC durante la noche. Las células lavadas se incubaron con Alexa Fluor 555 cabra conjugado anticuerpo anticonejo (Molecular Probes Inc.) durante 30 min a temperatura ambiente seguido de tres lavados con PBS. Finalmente, las células lavadas se contratiñeron con DAPI. Ortotópico del glioma del modelo y de tratamiento con cloroquina Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el bienestar de los animales y la realización experimental. Para la implantación intracraneal, se recogieron las células U87MG de cultivo en monocapa, se lavaron dos veces, y se resuspendieron en PBS a una concentración de 0,5 10 5 / L. Antes de la implantación, los ratones nude (NMRI, Taconic Europa) se anestesiaron mediante una inyección peritoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (120 mg de ketamina y 16 mg de xilazina en 10 ml de PBS) a 0,1 ml / 10 g de peso corporal. Para la implantación, el cráneo fue fijada en un marco estereotáxico (TSE Systems). Las células se inyectan en el caudato-putamen del hemisferio derecho del cerebro utilizando las siguientes coordenadas estereotácticas en referencia a la bregma: 1 mm (eje anteroposterior), 3 mm (eje lateromedial), y 2,5 mm (eje vertical). Un umbral de dosis de cloroquina con respecto a la toxicidad aguda del cerebro se estableció mediante la inyección de 5 l de 0,7, 7,0, 30, 70 o soluciones cloroquina mm en la cápsula interna del hemisferio derecho del cerebro de los ratones anestesiados con ketamina. En 70 mM, se encontró que las inyecciones repetitivas de cloroquina a ser tóxicos, ya que provocaron convulsiones en dos de tres ratones. Al 30 mM, inyecciones repetitivas de cloroquina fueron bien tolerados por todos los animales receptores y no causaron síntomas neurológicos. Por lo tanto, se utilizó una concentración de 30 mM de cloroquina para el tratamiento de xenoinjertos de glioma intracraneal. Al día 10 después de la implantación, 5 L de PBS o cloroquina se administró en el sitio utilizado para la inyección de las células tumorales por medio de un tornillo de inyección-bold guiado tal como se describe 33 para 17 días. Veintiséis días postimplante, los animales fueron sacrificados después de una inyección intraperitoneal letal de una mezcla de ketamina / xilazina (50 mg de xilazina y 350 mg de ketamina por peso corporal 1 kg). Los cerebros portadores de tumores se explantaron, se fijaron en formalina al 4, cortado en secciones coronales, y embebidos en parafina. De uno a secciones gruesas de tres micrómetros se colocaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las áreas más grandes tumorales se determinaron por examen microscópico de secciones histológicas consecutivos y se miden mediante el uso de software Cell-A-imagen (Olympus Soft Imaging Systems). secciones incluidas en parafina se anotaron para la apoptosis mediante el ensayo de TUNEL y la mitosis. Para el cálculo de la apoptosis, así como los índices mitóticos, hasta tres secciones de todo el tumor se puntuaron mediante el cribado del tumor en campos de alta potencia adyacentes. El número de mitosis o apoptoses contados se dividió por el número de campos de alta potencia (hasta 49) que se utilizan para la detección del tumor. Los análisis estadísticos Cada punto experimental ha sido realizado por triplicado por experimento a menos que se indique lo contrario los datos mostrados representan las medias (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Resultados La cloroquina inhibe el crecimiento celular de glioma Para evaluar el efecto de la cloroquina sobre el crecimiento de células de glioma, el crecimiento de un panel de líneas celulares de glioma con diferente estado de p53 funcional se analizó en presencia de concentraciones crecientes de la cloroquina. líneas celulares de glioma U87MG y G120 expresan wtp53. líneas G130 y G44 expresan ninguna o una p53 truncada debido a aberraciones cromosómicas brutas (G130) o una mutación sin sentido en el gen TP53, 31, respectivamente. G112 y U251 albergan una mutación TP53 dentro del punto caliente codón 273 y expresan p53 mutante transcripcionalmente inactiva. Los resultados mostraron que la cloroquina suprimió fuertemente el crecimiento de células de glioma de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1 A). Aunque se observó el efecto de supresión del crecimiento de la cloroquina en todas las líneas celulares ensayadas, las líneas celulares con wtp53 (U87MG y G120) aparecieron más sensibles a todas las dosis de cloroquina evaluadas en comparación con las líneas celulares que son nulos para p53 (G130), expresar p53 truncado (G44), o al puerto inactivación de las mutaciones de TP53 (U251 y G112). Para examinar si la inhibición del crecimiento por la cloroquina fue una consecuencia de la viabilidad celular afectada, se analizó el porcentaje de células viables en los cultivos no tratados o tratados con cloroquina utilizando un ensayo de exclusión de azul de tripano. Los resultados resumidos en la Fig. 1 B muestran que la cloroquina afecta a la viabilidad celular de glioma de una manera dependiente de la dosis. Dentro de la gama de las dosis de tratamiento de cloroquina probados, la viabilidad celular fue significativamente menor en las líneas celulares con wtp53 en comparación con líneas celulares mutp53-expresan, en consonancia con la idea de que el estado de p53 puede ser un factor importante que determina la sensibilidad de las células de glioma a la cloroquina. La cloroquina inhibe el crecimiento celular y la viabilidad glioma en cultivo. (A) Evaluación de las tasas de crecimiento celular en células de glioma con el estado funcional conocida de p53. 31 Las células se trataron con un intervalo de concentraciones de cloroquina indicadas en las leyendas. (B) Valoración de las tasas de muerte celular en células de glioma líneas con wtp53 (panel izquierdo) o la función de p53 deficiente (media y paneles de la derecha). Los valores representan la media de 6 repeticiones. La apoptosis contribuye a la muerte inducido por cloroquina en células de glioma cloroquina puede inducir la muerte celular por mecanismos distintos. Un mecanismo independiente de caspasas que implica la orientación lisosomal se ha descrito para algunos tipos de células nontumorigenic. 26, 34 Por el contrario, la apoptosis dependiente de caspasa se ha implicado en la muerte celular inducida por la cloroquina en diferentes tipos de células tumorales malignas 22, 35 y en algunos tipos de neuronas. 25 Para analizar los mecanismos de muerte cloroquina inducida en células de glioma, se evaluó características de la cascada de la apoptosis, incluyendo la activación de la caspasa-3 y la fragmentación de ADN genómico. células de glioma se trataron con cloroquina en una dosis de 30 g / ml, una concentración que se encuentra dentro de la ventana de concentraciones de cloroquina (2,040 g / ml) encontrado para ser citotóxico para todas las líneas celulares de glioma ensayadas (Fig. 1) y que fue suficiente para inducir la apoptosis en otros tipos de células tumorales. 22, 23, 27 La tinción de inmunofluorescencia para la forma escindida de la caspasa-3 reveló que el tratamiento con cloroquina condujo a la activación de caspasa-3, que es indicativo de la inducción de la apoptosis (Fig. 2 AC). Notablemente, las células tratadas con cloroquina generalmente mostraron un cambio característico en la morfología nuclear (ver inserción, Fig. 2 A), que, sin embargo, no coincide con la activación de caspasa-3. la activación inducida por cloroquina de la caspasa-3 se produjo de una manera dependiente del tiempo y se observó primero después de 48 horas de tratamiento con cloroquina (Fig. 2 A, se muestra por la línea de U87MG). Después de 96 horas de tratamiento, la mayoría de las células fueron positivas para la caspasa-3 escindida (Fig. 2 B) que indica una respuesta apoptótica robusto. La evaluación de la activación de caspasa-3 por la cloroquina en diferentes líneas celulares se resume en la Fig. 2 C. La activación de la caspasa-3 fue considerablemente más profunda en las células de glioma con wtp53 comparación con aquellos con p53 mutante (Fig. 2 C), lo que sugiere una contribución de las actividades wtp53 a la apoptosis inducida por la cloroquina. apoyando aún más el impacto de la apoptosis en la citotoxicidad mediada por la cloroquina, células de glioma tratados con cloroquina mostraron desintegración de ADN genómico como se demuestra por TUNEL (Fig. 2 D). Uno de los eventos tempranos inducidos por la cloroquina en células de glioma fue una disminución de la agregación mitocondrial del colorante fluorescente JC-1 indicativa de una distorsión de la integridad potencial de la membrana mitocondrial, que precedió a la activación de la caspasa-3 y ocurrió en un momento muy anterior , tan pronto como 24 horas después del tratamiento (Fig. 2 E). Curiosamente, un colapso del potencial de membrana mitocondrial causada por cloroquina produjo con una eficacia comparable en las células con wtp53 o mutp53 (Fig. 2 E), lo que indica que la disfunción mitocondrial causada por la cloroquina puede ser un efecto independiente de p53. La cloroquina induce la apoptosis en células de glioma en cultivo. (A y B) la activación dependiente del tiempo de la caspasa-3 por la cloroquina en las células U87MG. Las células no tratadas o tratadas a la cloroquina se tiñeron para la forma escindida de la caspasa-3 y contrastados por DAPI. El recuadro en (A) muestra la morfología nuclear característica de las células a la cloroquina tratada. (C) Resumen de la evaluación de la activación de la caspasa-3 en células de glioma líneas con diferente estado de p53. El porcentaje de células positivas para la caspasa-3 escindido se determinó contando un mínimo de 500 células en 510 campos microscópicos en réplicas de 3 para cada condición. (D) Evaluación de la apoptosis en células U87MG por TUNEL. Se utilizó un yoduro de propidio (PI) de contraste. (E) Los efectos de la cloroquina sobre la integridad potencial de membrana mitocondrial evaluados por mediciones de la acumulación mitocondrial de fluorescente JC-1 en células de glioma con wtp53 (U87MG) o mutp53 (G112). La proporción de rojo verde JC-1 de fluorescencia / se determinó en células no tratadas o tratadas con cloroquina durante 24 o 48 horas. La cloroquina conduce a la estabilización de la proteína p53 e induce p53 transcripcional objetivos en las líneas celulares de glioma con wtp53 El aumento de la sensibilidad a la cloroquina en líneas de glioma que expresan wtp53 endógeno en comparación con las líneas celulares que expresan mutp53 (Figs 1 y 2) sugerido una participación de la vía p53 en la citotoxicidad de la cloroquina. Por lo tanto, se evaluaron los niveles de proteína p53 y sus objetivos transcripcional en líneas celulares de glioma con el estado funcional conocida de p53 mediante análisis de Western blot. Los resultados mostraron que el tratamiento con cloroquina causó una marcada estabilización de la proteína p53, que era la cloroquina dependiente de la dosis (Fig. 3 A, se muestra por la línea de U87MG). La estabilización cloroquina inducida de la proteína p53 se consideró funcionalmente relevante, ya que fue acompañado por un incremento en la expresión de genes regulados por p53 (Fig. 3 B, panel izquierdo). Es importante destacar que la respuesta transcripcional de p53 cloroquina activado fue eficaz no sólo en la inducción de genes implicados en la regulación p53 y control del ciclo celular / la reparación del ADN (MDM2 y p21), sino también de los objetivos de apoptosis de p53 (PIG3 y bax). El aumento de la cloroquina inducida en los niveles de expresión de los genes diana de p53 también se observó en otras líneas celulares que expresan wtp53 como HCT116 y G168 (Fig. 3 B, el panel y los datos de la derecha no se muestra). En contraste, el tratamiento con cloroquina no indujo genes diana de p53 en las líneas de glioma que carecen de p53 funcional (Fig. 3 C). Estos resultados demuestran que la cloroquina conduce a un aumento en el nivel de proteína p53 e induce una respuesta transcripcional dependiente de p53 en células de glioma con wtp53. Dado que la actividad de p53 está regulada principalmente a nivel postraduccional 36, 37 y, como la cloroquina no influye en los niveles de transcripción p53, 38, examinó la posibilidad de que la cloroquina puede inducir modificaciones p53 postraduccionales conocidos para promover la estabilización de p53 en respuesta a diferentes tipos de celular estrés. En particular, estábamos interesados ​​en la evaluación de la fosforilación de p53 en un residuo de serina en la posición 15 (p53-Ser15), una modificación posterior a la traducción mediada por el ATM / ATR 39 y quinasas esenciales para la estabilización de p53 en las células de respuesta al daño del ADN. La vía de p53 es sensible a la cloroquina. la proteína p53 y productos de la conocida p21 p53 objetivos. MDM2. bax1. o PIG3 se evaluó en líneas de células de glioma con diferente status de p53 (AC) y en el carcinoma de colon HCT116 línea celular humana que expresa wtp53 (B) por Western blot. Las células se trataron con diferentes concentraciones de cloroquina durante 24 horas (A) o con una dosis constante de cloroquina (30 g / ml) durante los períodos de tiempo indicados (B y C). (D) La evaluación del estado de fosforilación de p53 en un residuo de serina en Ser15 U87MG (panel superior) y HCT116 (panel inferior) las células tratadas con cloroquina o la radiación ionizante. La forma fosforilada de p53 (p53-Ser15 P) se detectó utilizando un anticuerpo 16G8 fosforilación sensible, que sólo reconoce la isoforma fosforilada p53-Ser15 P. detección de p53 fue total por el anticuerpo DO-7. El componente de tubulina citoesqueleto de expresión ubicua o el factor de transcripción basal TBP se evaluó para asegurar la igualdad de la carga de proteínas. El estado de fosforilación de p53-Ser15 se evaluó en células U87MG tratados por la cloroquina o por-irradiación. Como era de esperar,-irradiación indujo a una rápida fosforilación de p53-Ser15, que precedió a la estabilización de la proteína p53 (Fig. 3 D, panel superior, comparar los niveles de p53-Ser15 P con los niveles totales de p53 en los carriles 14). Estos resultados indican que dañan el ADN dependiente de señalización convergen en p53 está intacta en las células U87MG. Por el contrario, la estabilización de p53 después del tratamiento con cloroquina, aparente ya 6 horas después del tratamiento (Fig. 3 D, panel superior, compara los niveles de p53 total en la carriles 5 y 7), no fue acompañada por la fosforilación apreciable a p53-Ser15 sobre los niveles de línea de base (comparar los niveles de p53-Ser15 P con los niveles totales de p53 en los carriles 14 y 58). Se observó que esta falta de correlación entre la estabilización cloroquina inducida por p53 y su fosforilación en Ser15 no sólo en las células de glioma pero también en el contexto diferente celular de una línea celular de carcinoma de colon HCT116, un paradigma experimental utilizado ampliamente de la vía de p53. 40 De manera similar al patrón observado en las células de glioma, las células HCT116 responder a la cloroquina por una estabilización marcada de la proteína p53 y la inducción de genes diana de p53 (Fig. 3 D, panel derecho). En contraste con la fosforilación robusta y rápida de p53-Ser15 inducida por - radiation (Fig. 3 D, panel inferior, comparar los niveles de p53-Ser15 P en los carriles 2, 5, y 8 con los niveles basales p53-Ser15 P mostrados en el carril 1), tratamiento con cloroquina no causó un aumento considerable en la fosforilación de p53-Ser15 (comparar los niveles de p53-Ser15 P en los carriles 3, 6, y 9 con los niveles basales p53-Ser15 P mostrados en el carril 1). Estas observaciones sugieren fuertemente que la estabilización de p53 y la activación de p53 respuesta transcripcional por la cloroquina puede depender de distintos mecanismos de señalización inducida por daño en el ADN. Inducción de apoptosis por p53 cloroquina Requiere Los hallazgos de que la cloroquina induce la apoptosis y activa la vía de p53 planteó la cuestión de la relación causal entre ambos fenómenos. Para abordar esta cuestión, se evaluó los efectos de la caída de p53 sobre la eficacia de la apoptosis inducida por la cloroquina. líneas celulares de glioma se transfectaron con disponible comercialmente p53-siRNA para inhibir la p53 endógena. Las células transfectadas con ARNsi inespecífico (scr-siRNA) se utilizaron como control. La inhibición de la p53 por siRNA-p53 fue confirmada por la tinción de inmunofluorescencia para la proteína p53 (Fig. 4 A) y por análisis de transferencia Western (datos no presentados). líneas celulares de glioma transfectadas con p53-siRNA o con scr-siRNA se trataron con cloroquina durante 72 horas y se evaluaron para la caspasa-3 activada. A marcar el ritmo de las células apoptóticas, el porcentaje de células positivas para escindido se determinó la caspasa-3. Los resultados mostraron que la inhibición de wtp53 por p53-siRNA condujo a una reducción significativa en el número de células positivas para la caspasa-3 activada en U87MG cloroquina tratadas y células G120 expresar wtp53 (P 0,0009 y 0,012, respectivamente, Fig. 4 SEGUNDO). En contraste, la inhibición de mutp53 en la línea de G112 no tuvo efecto sobre las tasas de apoptosis inducida por la cloroquina en la p53-siRNA o células transfectadas con scr-siRNA (Fig. 4 B). Estos resultados demuestran que wtp53 función es esencial para la inducción de apoptosis por la cloroquina. La inhibición de p53 disminuye la respuesta apoptótica a la cloroquina en líneas celulares de glioma con wtp53. (A) Evaluación de la eficacia de la inhibición de p53 endógeno mediante transfección con siRNA inespecífico scr-o-p53 siRNA. células U251, que expresan altos niveles de mutp53 endógenas fueron transfectadas con scr-siRNA o p53-siRNA y se tiñeron con anticuerpo DO-7 para determinar el efecto de siRNAs. (B) la inhibición de p53 por p53-siRNA disminuido significativamente (P 0,02) la activación de caspasa-3 en líneas celulares de glioma con wtp53 pero no en mutp53 líneas. El porcentaje de células con la caspasa-3 activada se determinó contando al menos 500 células en 510 campos microscópicos de tres cubreobjetos replicados. Los resultados mostrados representan la media de dos experimentos. La cloroquina inhibe el crecimiento de glioma Experimental Nuestros resultados que la cloroquina induce la muerte de las células de glioma cultivadas nos llevó a examinar los efectos de la cloroquina en un modelo de ratón ortotópico de glioma. 41 Los ratones desnudos se implantaron por vía intracraneal con células U87MG y asignados al azar a la cloroquina o el tratamiento con placebo. Diez días después de la implantación (aproximadamente un tercio de la supervivencia media de los ratones U87MG implanta en este modelo de xenoinjerto), un grupo recibió una inyección diaria de cloroquina intratumoral en PBS y el segundo grupo se le administró PBS solo. Veinte y seis días después de la implantación, los animales fueron sacrificados y los cerebros portadores de tumores se procesaron para histología. Las mediciones histomorfométricos revelaron una reducción significativa en el tamaño medio de tumor en el grupo de cloroquina en comparación con el grupo control (P 0,0068) (Fig. 5 A, panel izquierdo). tumores cloroquina tratados mostraron un número significativamente menor de células mitóticas en comparación con el grupo control (P 0,0018) (Fig. 5 A, panel central y la Fig. 5 B), mientras que el número de células apoptóticas por TUNEL fue significativamente mayor en la cloroquina tumores tratados con en comparación con el grupo tratado con placebo (P 0,0019) (Fig. 5 A, panel de la derecha y la Fig. 5 C). Estos datos confirman nuestros datos in vitro y demuestran que la cloroquina es eficaz en la supresión del crecimiento y la inducción de la apoptosis de glioma experimental in vivo. El tratamiento de glioma experimental con cloroquina in vivo. Los volúmenes tumorales y mitóticas y apoptóticas se determinaron los índices en los tumores U87MG cloroquina o tratados con PBS como se describe en la sección Materiales y Métodos. (A) los tumores tratados con cloroquina muestran una disminución significativa en el volumen promedio del tumor y un índice mitótico inferior, pero las tasas significativamente elevados de células apoptóticas. El análisis de los datos se realizó mediante un análisis de varianza de una sola vía. (B) representativos de hematoxilina / eosina secciones histológicas. Las puntas de flecha indican las células mitóticas. (C) Representante de TUNEL-manchado secciones histológicas. Las puntas de flecha indican las células TUNEL positivas. Discusión Este estudio demuestra los efectos de la quinolina cloroquina derivado en el crecimiento y la viabilidad de las células de glioma en cultivo y en glioma experimental en ratones desnudos. Los resultados muestran que la inducción de la apoptosis mediada por p53 es uno de los mecanismos subyacentes a los efectos de crecimiento de supresión de la cloroquina. Aunque hay alguna evidencia preliminar y empírica de que la cloroquina puede retardar la progresión de glioma y mejorar el resultado en pacientes con glioblastoma, 30 de las bases moleculares de los efectos de cloroquina inducida en células de glioma siguen siendo poco caracterizada. Se demuestra que la cloroquina causa una estabilización sostenida de la proteína p53 y activa p53 respuesta transcripcional en células de glioma. Esto sugiere que la vía de p53 desempeña un papel esencial en la supresión mediada por la cloroquina del crecimiento celular y la apoptosis. En apoyo de esta conclusión, la respuesta apoptótica a la cloroquina se ve disminuida en las células de glioma cuando se wtp53 experimentalmente inhibido por p53 siRNA. Aunque los mecanismos precisos por los que la cloroquina se activa el brazo de apoptosis de la respuesta de p53 necesita una aclaración adicional, nuestros datos sugieren que la transcripción dependiente de p53 de genes proapoptóticos inducidos en respuesta a la cloroquina puede estar implicado. Otra posibilidad no excluyente es que la cloroquina también puede promover una vía nontranscriptional a la apoptosis mediada por la fracción de mitocondrias asociada de p53. 42 Este último no se opone a una transcripción dependiente de p53 de los genes pro-apoptóticos por la cloroquina. La función supresora de tumor de p53 se basa en su capacidad para actuar como un factor de vigilancia responsable del mantenimiento de un genoma libre de error o como un potente inductor de la muerte celular. La prevalencia de las actividades supervivencia - o muerte de promoción de wtp53 parece ser dependiente del contexto celular y el mecanismo de acción específico de un factor de estrés en particular o de drogas. Para los tratamientos citotóxicos que inducen daños en el ADN, se piensa que un interruptor entre las actividades supervivencia - y apoptosis promoción de p53 a ocurrir cuando la magnitud del daño de ADN supera la capacidad de reparación del ADN de la célula. En el otro lado, una reparación satisfactoria de lesiones del ADN sirve como señal de realimentación para volver a entrar en el ciclo celular, que requiere la reducción de la proteína p53 a los niveles de base. Dado que las células de glioma radioresistant están equipadas con mecanismos extraordinariamente eficiente de reparación del ADN y la capacidad de activar los puntos de control de daño de ADN, 43 un interruptor a las actividades de muerte que promueven la de p53 solamente puede ocurrir a dosis que puede ser difícil de lograr en la fijación de ADN clínicamente relevante agentes - damaging. Ninguno declarado.